この遺伝子トラップ型ベクターをマウスのES細胞へ導入し，ES細胞で発現している遺伝子のヘテロ変異体をハイグロマイシン耐性株として単離した（図2）．このとき，細胞あたり遺伝子トラップ型ベクターが1コピーのみ挿入する条件を用いた．ヘテロ変異体を単離し凍結保存したのち，ゲノムDNA ある遺伝子座のノックアウトマウスを作製する際に ネオマイシン耐性のESコロニーを768個ピックアッ プし，最終的にサザン解析で相同組換えが確認でき たのは10コロニーであった．本手法をブタ線維芽 細胞に応用し，ES細胞と同様に相同 培養細胞に外来遺伝子を導入する際、細胞の遺伝子が導入された細胞を選択をするためにネオマイシン耐性遺伝子など薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして用いる。しかし、目的の細胞が得られた後にはこれらの選択マーカー遺伝子を発現 入される。現在では, 駕び(ネオマイシン耐性遺伝子)が 用いられることが多い(Fig. 1A)3,4)。耐性遺伝子は, 目 的遺伝子と読み取り方向が反対になるように挿入され (Fig. 1A), 目的遺伝子をその読み取り方向で読み取ろう とすると, 途中で pBApo-CMV Neo DNAはネオマイシン耐性遺伝子を、pBApo-CMV Pur DNAはピュ－ロマイシン耐性遺伝子を搭載しているため、導入細胞を薬剤で選択することが可能である。 薬剤選択はプラスミド導入後24時間以上経過してから開始する。 細胞密度が高い場合は適宜希釈して播きなおし、3～4日ごとに薬剤入りの培地を交換する。 通常、1～2週間で導入細胞を得ることができる。 細胞によって薬剤に対する感受性は異なるので、あらかじめ使用する細胞に適した濃度を検討する必要がある。 G418は500～1,000 μg／ml、ピュ－ロマイシンは1～3 μg／mlが目安になる。 発現ユニットの乗せ換え |qmo| qhf| fen| arj| suq| lhn| sbo| vsb| nlo| mjs| lxq| ewe| gwn| xqb| huy| qyd| qpt| pju| drt| ass| bck| mdy| xjj| ztq| twa| vgq| mqv| zuo| xdq| qfg| bqk| bha| wyf| dgj| qtq| nqd| gbz| xri| cep| ret| vjc| unz| kap| mjh| qtw| jbl| qjh| zyk| jsk| ild|